第五届“医疗机构制剂发展论坛暨新药研发、转化实操要点”专题沙龙
年9月下旬兰州
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中药生产工艺验证合规研究要点及常见问题点评高级研修班
/08/27网络授课
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联系人：邢老师
基于生物活性与效应基准的中药质量评价技术发展现状与展望
张萌封亮贾晓斌
中国药科大学中药学院
摘要中药质量的评控问题是制约中药现代化发展的瓶颈,因此有必要在现有检测方法的基础上结合生物评价,继而更为全面地保证中药质量。生物评价是完善中药质量标准、保证临床功效和安全性评价的重要方法,已成为中药质量标准化发展趋势之一。在此处主要论述了近年来基于生物活性与效应基准的中药质量评价技术和已取得的部分研究进展,同时对目前中药质量生物评价研究与应用中存在的主要问题进行探讨,进一步对其未来应用做出展望,从而更好的对中药质量进行控制。中药质量是中药发挥临床疗效的保障,对于中药质量的控制与评价研究一直是推动中药现代化进程中的重点和难点[1]。中药多组分、多靶点、多途径的特点决定了其物质基础和作用机制的复杂性。随着现代分析技术的飞速发展以及各学科交叉的融合创新,中药质量评价研究有了全方位的进步,经历了从形态鉴别到化学成分定性及定量检测再到全过程动态控制,从单个指标的含量测定到基于指纹图谱的多指标同时测定,从基于对照品的含量测定到一测多评等变化,从整体上对中药质量评价水平进行了提升[2]。然而,仅基于化学基准的中药质量控制模式存在指标性成分难以全面地反映整体质量、与临床有效性及安全性关联不够紧密、不能充分体现中医药特色等问题,仍存在较大的局限性。因此,有学者提出构建“中药品质标准评控力金字塔”,在基于化学基准的基础上增加效应基准,逐步建立以生物评价为核心手段和指标之一的中药质量标准体系,这将是中药质量标准化建设的重要发展方向[3]。基于化学基准的中药质量评价重在检验药材的“真伪”,而基于生物活性与效应基准的中药质量评价重在把关药材的“优劣”。生物评价以理化分析和常规检定为物质化前提,常规检定以生物评价为效应性判定,两者应是相辅相成、互为补充[4],共同完善中药质量评价体系。见图1。表1基于生物活性与效应基准的中药质量评价技术特点与适用范围图1中药质量评价技术组成结构
生物评价技术是以药物的生物效应为基础,利用整体动物、离体组织、器官、微生物和细胞以及相关生物因子等为试验系,评价药物有效性或毒性的方法,是继性状评价、化学评价之后,推动中药质量标准走进临床、关联疗效的关键举措[4]。年肖小河研究团队首次提出将生物评价作为中药质量评价的重要内容[5],构建基于道地药材和生物评价的中药质量评价模式,促进了中药质量生物评价的蓬勃发展。继版《中华人民共和国药典》一部[6]收录“中药生物活性测定指导原则”后,版《中华人民共和国药典》[7]增添了“基于基因芯片的药物评价技术与方法指导”和“中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则”,版《中华人民共和国药典》又增加了“DNA测序技术指导原则”和“标准核酸序列建立指导原则”[8]。美国FDA也于年发布《植物药开发指南(草案)》[9],明确指出与临床疗效相关的生物检测方法是植物药质量控制手段的发展方向,预示着生物测定必将成为中药质量评价体系中的重要指标之一。目前中药质量生物评价技术大体可分为2大类:1)基于遗传信息的中药基原DNA分子鉴定,如随机扩增多态性DNA(RAPD)、DNA条形码等,主要用于中药基原的鉴定;2)基于生物效应的中药生物活性测定,主要用于中药质量的有效性和安全性评价[4]。近年来,随着生物检测技术的发展,现代生物评价方法也有了新的手段,相继出现了热活性指纹图谱(ThermalActivityFingerprint)、细胞指纹图谱(CellFingerprint)、生物自显影薄层色谱(BioautographyTLC)、高内涵分析(HighContentAnalysis)、生物芯片(Biochip)等生物效应表达谱检测方法,能够同时满足对中药的定性鉴别与定量评价,在中药质量一致性评价中具有优势。生物标志物(Bio-marker)是标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生改变的生物学或生物化学指标[10]。用于中药质量控制的生物标志物(Q-Bio-marker)是能够反映中药临床功效或药理作用的生物活性指标,可以将生物效应进行量化,关联中药的有效性、安全性和一致性[11],理论上可用于大多数中药的质量评价,特别适合用于化学成分及药效作用机制不清楚且缺乏定量药效评价指标的中药[12],包括生物活性值或效价(Biopotency)、生物活性标志物(Biomarker)、生物效应表达谱(BiologicalFingerprint)等。除此之外,中药质量生物评价方法还包括效应成分指数(EffectiveComponentsIndex,ECI)、效应当量(EfficacyEquivalent,EE)、道地指数(Dao-diIndex,DDI)等综合性指标。基于生物活性与效应基准的中药质量评价技术特点与适用范围。见表1。1中药生物活性测定技术生物活性测定与中药临床疗效和安全性的关联性较为紧密,是反映临床功效的基本方法之一。其以药物的生物效应为基础,以生物统计学为工具,结合中药及其制剂的主治功能或不良反应,通过比较对照品和供试品对生物体或离体器官与组织、生物标记物等特定的生物效应,从而评价和控制中药整体的质量和活性。测定技术包括生物效价测定法、生物活性限值和毒价测定[13]。其中,生物效价与生物活性限值的区别在于前者在一定剂量范围内的量效关系明显,而后者往往在达到某一特定值(如给药量)后,才表现出某效应,如出现死亡、惊厥等,属于半定量或定性范畴。1.1生物效价测定技术生物效价可以较好地反映中药产品的整体活性,并关联中药功效,适用于化学物质基础不明确、常规理化方法难以评价其质量或不能反映其临床生物活性的中药及其制剂[11]。通过选择直接关联功效的生物效价分析方法能很好弥补化学评价方法的不足,为中药的整体质量评价提供新的研究思路。曹喆等[14]以麻黄“发汗散寒”的功效为基础,建立大鼠发汗药理模型,以大鼠发汗量为检测指标,测定不同产地麻黄对大鼠足后跖发汗斑点数的影响,结果表明,不同产地麻黄发汗效价与麻黄碱、伪麻黄碱总量之间的相关性不显著,提示麻黄中可能还含有更强的具有发汗作用的化学物质或麻黄发汗作用是多种成分协同作用的结果,为麻黄质量评价研究提供新的研究思路。将生物评价方法引入动物类中药的质量评控中,尽可能多地反映其功能主治,可弥补动物类中药质量控制缺陷的现状[15]。例如,对于清热解毒类动物药,如麝香、水牛角等,可采用抗菌、抗炎及解热作用评价其清热解毒功效,在此基础上建立了酶免疫法、微量热法等生物评价方法,有效地提高了质量控制水平。对于滋阴补血类动物药,如阿胶、冬虫夏草等,可利用吞噬细胞等免疫学功能的改变、构造生物衰老模型等来评价其免疫调节、增强造血及抗衰老的疗效,直接反映其滋阴补血之功效,类似的还有活血化瘀类及壮阳益肾类动物药等。Zhang等[16]综合分析了不同产地三七的化学标志物(三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd)、生物效价(抗凝活性)和生态因素(经度、纬度、海拔等)来评价三七的质量,利用这些参数可以有效地区分来自不同产地的三七,由此建立了可靠的质量评估体系。在中药成方制剂方面,曹波等[17]利用基于体外抗血小板聚集的生物效价检测方法,以小金丸临床活血化瘀功效为出发点,评价其质量的一致性,并筛选出地龙、五灵脂和木鳖子可能是小金丸组方中发挥活血作用的关键中药。1.2生物活性限值测定技术生物活性的存在是实现药效作用的前提和基础,未能建立生物效价测定的中药可采用生物活性限值测定法,生物活性限值是一种定性或半定量的评价方法,可采用中药成分或化学药品作为方法可靠性验证用对照品[13]。高天红等[18]建立红花注射液的生物活性限值测定方法,以综合评价其产品质量。使用胶原-肾上腺素诱导小鼠急性脑血栓模型,以红花注射液对小鼠的偏瘫保护率作为指标,考察红花注射液的抗血栓生物活性。结果表明使用5.0g生药/kg的红花注射液连续3d腹腔注射给药,对胶原-肾上腺素诱导小鼠急性脑血栓具有明显的保护作用,同时建立的生物活性限值方法重复性、中间精密度、实验室间重现性良好,因此建议以5.0g生药/kg剂量作为红花注射液生物活性工艺优化和产品质量控制的限值。Li等[19]构建了一种生物测定方法评估何首乌的抗血小板聚集作用,并结合化学方法鉴定了抗血小板聚集标志物,可将样品质量与中药临床疗效相关的潜在化学标志物相关联。周雪等[20]以天麻超微粉对小鼠自发活动的影响,以及其对小鼠戊巴比妥钠诱导睡眠时间的影响为考察指标,研究了天麻超微粉镇静催眠作用的生物活性限制测定方法,该法可作为天麻超微粉的生物活性质量标准,能有效配合传统检验方法对天麻微粉化制剂进行质量监控。1.3生物毒价测定技术中药毒性具有现代生物技术难以检测的微小毒性、综合毒性等特点,是中药安全性评价的关键问题之一。如何准确、快速、高效地评价中药的毒性,是中药毒性研究的重要方向[21]。化学毒性评价存在一定的问题,如部分成分不能完全代表有毒中药的整体毒性,成分之和简单相加缺乏依据等。而生物毒价可直接反映中药产品的毒性,与生物效价检测方法相似,是一种关联临床、客观准确、快速经济的评价方法,可用于中药的安全性评价。以毒价作为统一的毒性标示对药材生产、加工、炮制等环节质量进行序贯控制,可辅助医生在临床上根据标示毒价调整剂量,确保用药安全[4]。例如中药附子具有回阳救逆、补火助阳的功效,而附子所含的多种强心成分具有较强的心脏毒性,可从生物活性层面对附子进行质量控制。刘蕾等[22]利用生物活性限制测定方法,以附子抑制心肌细胞活力的效应作为生物活性评价指标,研究了不同来源附子水提物对大鼠心肌细胞H9c2毒性的影响,探讨其毒性剂量限值及其检测限。结果确定了15.6μg/mL可作为限值剂量,在该限值浓度下对大鼠心肌H9c2细胞活力抑制率为20%～24%,可作为质量合格的标准。赵志浩等[23]通过测定附子引起的大鼠室性早搏的最小中毒量,建立了附子毒性成分指数,作为附子炮制品减毒程度和质量评价的重要参考指标,评价了生附片、黑顺片、白附片、蒸附片、炮天雄、刨附片的生物毒性,该方法具有快速、准确、经济易行的技术优势,还可用于不同商品等级的黑顺片、附子配方颗粒、含附子的注射剂以及川乌、草乌等的质量评价,为毒性中药的质量评控与临床应用提供了新的思路与方法。华桦等[21]利用Microtox技术测定金银花醇提物、山银花醇提物对发光菌发光强度抑制率,计算发光细菌半数抑制浓度(IC50),来评价金银花、山银花提取物的毒性,与小鼠急性毒性试验比较,该法快速、简单、灵敏度高,可为全面评价中药安全性提供参考。生物活性测定法能更为直接地表征中药的生物活性,但也存在一定的局限性。鉴于生物效毒价检测多为离体细胞、组织、器官的定量药理反应,且是基于某一特定药理条件下的活性测定结果,尚不能完全反映中药在疾病状态下的治疗作用[3]。采用生物限值法用于中药生物活性质量控制,需在实验系统稳定的情况下进行评价,这也是其在生物活性方面对中药进行质控的局限[22]。理论上,实验方法学考察的变异系数越小越好,但是生物效价检测方法存在一定的因生物个体差异而引起的误差,因此准确度、专属性和精密度等较低,与化学分析方法存在差距。标准品的选择也是中药生物活性测定法的重要问题之一,理想的生物效应评测标准品应与供试品是同质的,在一定剂量范围内,可视为供试品不同程度的浓缩物或稀释物,最大限度地消除测定系统误差,但由于中药成分复杂,目前尚无用于生物效价研究的标准品。对此,有必要建立针对某一药理活性的标准品以量化药理活性[1]。2效应成分指数评控技术效应成分指数(ECI)是一种综合量化的评价指标,融合了化学评价的精准性与生物评价关联药效和安全性的优势,是一种关联中药临床功效与活性的评价方法,克服了目前中药质量评价指标片面、分散、脱离药效等弊端,适用于药效物质及活性成分相对明确的中药。对于有效性来说,ECI越高,表明质量和疗效越好;针对安全性,毒性ECI越高,表明安全性风险越高。基于效应当量(EE),还可以对不同质量的中药进行剂量调整,从而实现疗效稳定,解决质量差异对临床疗效稳定性的影响[12]。由于不同来源的中药化学组成存在一定的差异,这将导致它们在质量和功效方面存在显著差异,而现有的质量评价方法不与功效相关,不能反映不同化学成分对整体药效的贡献度。ECI评控方法可为临床中药实现辨质用药、优质优价和科学监管提供新的科学依据和技术支持。谭鹏等[24]构建了一种基于生物效价权重系数加权的多组分化学定量分析的大黄质量评控模式——致泻效应成分指数。采用UPLC同时测定大黄中12个化学成分的含量,利用ICR小鼠便秘模型测定12个化学成分的致泻生物效价,以番泻苷A的致泻生物效价为基准,得到各个化学成分的生物效价权重系数(ECE),进而计算大黄致泻效应成分指数。该指数有望指导临床中医师更合理地使用不同来源的大黄:当大黄用于治疗便秘时,可选用ECI数值较高(15～20)的大黄;当大黄用于治疗其他疾病时,可选择ECI数值较低(1～10)的大黄,从而避免ECI数值较高的大黄带来的剧烈腹泻不良反应。因此,效应成分指数方法有望成为传统中药质量评控方法的有益补充。程斌等[25]运用化痰效应成分指数对浙贝母品质进行评价,实现了从量到效、量中含效,可全面评价浙贝母的内在品质,为其产地加工工艺、市场流通提供客观、可量化的参考依据。Chen等[26]建立了中药大果飞蛾藤的ECI,对大鼠血浆中的生物效价和成分进行了分析,结果表明所建立的ECI可以有效地对大果飞蛾藤进行质量评估,同时结合一测多评法对多组分进行定量分析,可提高已建立的ECI的实际应用价值。在中药制剂的生物评价方面,谭鹏等[27]将多指标成分同时定量分析和生物效价分析方法结合,进行大黄配方颗粒的质量评价研究,在化学成分含量测定的同时进行致泻生物效价和体外抗血小板聚集研究,比较不同批次大黄配方颗粒的活血生物效价,结果表明10个批次间大黄配方颗粒的化学表征、致泻、活血生物效价均存在一定的差异性,采用多组分化学表征和生物效价检测联用的模式可以客观量化、更全面的反映不同批次大黄配方颗粒的整体质量差异。张慧等[28]建立基于ECI的双黄连制剂质量控制方法,采用抗生素微生物检定法检测不同来源双黄连制剂的抗菌效价,结合HPLC定量指纹图谱与偏最小二乘-判别分析法(PLC-DA)进行“量-效”相关性分析,筛选出野黄芩苷、绿原酸、黄芩苷、连翘脂苷A为双黄连制剂的抗菌功效成分,药效权重系数证实所测得的抗菌效价与功效成分指数呈正相关,可实现以ECI进行双黄连制剂的质量评控。ECI简单易行,能定量、定效地表征中药质量。然而,ECI的构建也存在一些缺陷和不足。由于多种成分的协同或拮抗作用将影响中药质量的整体评价,如何确证药材中与临床功效相关联的活性成分,如何表征这些活性成分之间的协同或拮抗作用将成为ECI法面临的挑战[24]。3生物效应表达谱生物效应表达谱(Bio-responseProfile)是指在特定的实验条件下,供试药物作用于生物体系所表达出的一组特征生物学信息或图谱,通常具有时间-效应或剂量-效应依赖关系[12],包括生物热活性指纹图谱、基因表达谱、蛋白质表达谱、代谢物表达谱、细胞表型特征谱、生物自显影薄层色谱等。相对于经典生物效价检测,生物效应表达谱能反映药物作用于生物的更多指纹和(或)动态信息[12],具有指纹性或专属性,不仅可以鉴别中药的真伪优劣,还可用于中药质量波动监测。赵恒强等[29]利用基于DPPH-HPLC技术的抗氧化活性指纹图谱对马粪海胆进行分析,并对具有较好抗氧化活性的马粪海胆水提物中的成分进行筛选,结合指纹图谱与相似度分析对不同来源的马粪海胆进行鉴别,为海洋中药的质量控制和真伪鉴别研究提供了新方法。中药注射剂成分复杂,包含多种不同化学类别的化合物,如类黄酮、皂苷和多糖等。产品质量问题是引起中药注射剂不良反应的重要原因之一,因此对其进行质量控制与安全性评价至关重要[30]。由于化学分析方法所提供的信息与体内活性之间缺乏相关性,无法保证中药注射剂的临床安全性和有效性。将生物效应表达谱引入中药注射剂的质量控制体系有助于提高其质量标准。Feng等[31]利用化学指纹图谱和生物测定法建立了红花注射液的质量标准,包括基于细胞的生物学特征测定和酶促测定,根据靶细胞相关的变态反应和红花注射液的凝血酶抑制活性,可监测RBL-2H3细胞系对不同红花注射液的反应,并获得了相应的基于细胞的生物学特征测定信息,同时鉴定了红花注射液中的33种化合物,其中黄芩苷和山柰酚-3-O-芸香糖苷被认为是造成临床不良反应的物质。此外,生物热活性图谱可以区别高温处理样品及污染变质样品,全面反映模型生物的热生物学信息,提供专属性较强的二维信息,因此可作为化学特征图谱的有益补充[30]。从质量均一性出发,以中药注射剂的主要功效为着眼点,采用微量量热法,以生物热活性图谱及热动力学参数等定性定量地表征中药注射剂的功效差异[30],由此建立了注射用双黄连冻干粉、注射用益气复脉冻干粉、清开灵注射液、茵栀黄注射液等中药注射剂的热活性指纹图谱[4]。该法可以灵敏准确地区分不同批次产品、不同处理样品及污染样品的生物活性差异,实时监测中药注射剂的质量信息,为其质量一致性和稳定性评价提供新的方法。4基于生物活性与效应基准的中药质量评价技术存在的问题基于生物活性与效应基准的中药质量评价技术虽然取得了重要进展,但其对临床合理用药和临床疗效提升的指导和支持作用一直难以体现[4],具体存在以下问题亟待解决。首先,复方中某些具有传统药理功效的成分由于含量较低,所占比例小,未达到起效浓度,可能显示不出其生物评价效应。中药质量生物评价方法不同于一般的药理学实验及化学评价,其与药理药效评价的区别在于前者的最终目的是对中药及其制剂的质量进行评控,而后者仅仅在于筛选药理成分及探讨作用机制。中药质量生物评价须具备定量药理学与药检分析的双重属性和要求,其方法学考察既包括试验设计、量化指标、剂间距、分组、对照、可靠性检验等定量药理学的内容,还包括线性范围、精密度、重现性等药物分析的内容[4]。且在生物评价的过程中,不应以化学评价中的方法学指标为参照,其专属性、准确性及检验误差等不及理化鉴定,但由于其针对主要功效即可建立相关性好、操作性强的检测方法,与中药的安全性、有效性相关联,加之采用生物鉴定设计和统计方法,因此具有较好的重现性和稳定性。其次,生物评价方法的通用性较差,难以同时满足数量众多的中药及其制剂的质量评控。由于中药成分复杂,如何有效地进行生物效应评价是一个需要不断探索和完善的问题[32]。同时,中药质量生物评价短时间内难以在基层检验机构和研究机构全面普及,即存在一定的可及性和普适性难题,因此至今尚未建立中药生物效应评价法的标准体系。5结语中药现代化、国际化发展的关键在于中药的安全性、有效性、质量稳定性与质量标准的完全控制[10]。基于化学基准的中药质量控制模式由于脱离中药多成分协同起效的整体性特点,不能准确反映临床疗效、评价中药及其制剂的质量。中药生物效应法作为一种新的质量控评手段,具有药效相关、整体可控的优势,将成为中药质量标准化的重要发展方向。见图2。生物效价测定法可以很好地反映中药的整体活性和临床疗效,在评价中药质量的安全性和有效性方面具有独特的优势;效应成分指数整合了化学评价和生物评价的技术优势,具有多指标整合量化集成的特点;生物效应表达谱具有专属性和特异性,可促进中药质量一致性评价。但生物评价仍尚处于探索阶段,应与理化分析技术结合使用、互为补充,以更科学、有效地进行中药质量控制。针对不同功效的中药,应选择能够反映其临床疗效的生物活性测定方法,进行全面、深入地研究,制定关联临床、可量化的质量评控体系,促使中药产业高质量发展。END联盟服务内容包括但不限于：
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