从车前子中寻找抗异常性疼痛的化合物 [复制链接]

背景介绍

化疗是一种广泛使用的癌症治疗形式。几种化疗药物包括紫杉醇(PTX)、奥沙利铂、长春新碱、硼替佐米和其他药物会引起严重的副作用，如呕吐和周围神经病。化疗引起的周围神经病变(CIPN)的特征是机械性异常性疼痛、瘫痪、疼痛、刺痛和麻木，具有典型的“袜子和手套”症状分布。CIPN是癌症化疗的剂量限制副作用之一，甚至在停止药物治疗后也可能持续存在。更糟糕的是，由于CIPN对行动能力和简单日常活动的影响，它会导致患者生活质量的下降。使用目前可用的治疗药物很难控制CIPN症状。此外，CIPN的潜在机制仍未得到充分理解。因此，发现治疗CIPN的新治疗剂是一个高度优先的领域。

Goshajinkigan(GJG)一种由十味药材组成的配方[地*，牛膝，山茱萸，山药，车前子，泽泻，茯苓，牡丹皮，肉桂，川乌]，传统上用于治疗下背部和腿部的运动无力、对寒冷的敏感性、疼痛、麻木、排尿减少、夜间遗尿、水肿和腰痛，以及周围神经病的症状。基于其疗效的经验证据，GJG已被用于治疗糖尿病神经病变，并且GJG用于治疗和预防CIPN的临床应用正在增加。虽然有几项研究已经检验了GJG对CIPN的影响，但GJG的活性成分对CIPN的疗效及其药理作用的分子机制尚未完全了解。

此前，作者使用PTX诱导的异常性疼痛小鼠模型，比较了GJG和Hachimijiogan(一种相关配方)的抗异常性疼痛作用。Hachimijiogan源自GJG，缺少两种生药成分，车前子和牛膝。有趣的是，虽然GJG表现出了抗异常性疼痛的作用，但Hachimijiogan没有这种活性。这些研究表明GJG中的车前子或牛膝可能含有抗异常性疼痛活性。后续研究显示，服用车前子水提取物(口服，0.3g/kg，每日)可显著抑制PTX诱发的机械异常性疼痛。EPS的这种作用是剂量依赖性的，因为较低剂量的EPS(0.1g/kg，口服，每日)缺乏显著的抗异常性疼痛活性。相比之下，服用牛膝水提取物(口服，每日0.3-0.03g/kg)不能抑制PTX诱发的机械异常性疼痛，表明车前子中存在具有抗异常性疼痛特性的活性化学成分。在本研究中，作者使用活性导向的胞外多糖分离鉴定胞外多糖中的抗异常性疼痛化合物，并在PTX诱导的异常性疼痛小鼠模型中评估分离的化合物。

研究结果

为了鉴定车前子中的抗异常性疼痛化合物，对其热水提取物进行了活性导向分离。除去多糖后通过使用甲醇沉淀，上清液进行DiaionHP-21柱层析以获得六个级分(水洗脱液、20%、40%、60%、80%和%MeOH洗脱液)。在PTX处理的小鼠中评估这些组分的抗异常性疼痛作用。单次服用PTX(5mg/kg，口服)可诱发机械性异常性疼痛。在这个模型中，异常性疼痛评分在第14天达到峰值，到第39天几乎恢复正常。因此，我们评估了PTX注射后直至第14天每天的馏分和化合物对异常性疼痛的影响。除了20%MeOH洗脱液(0.3g/kg)显著降低了异常性疼痛评分(图1)之外，所有级分的异常性疼痛评分与赋形剂2组相同。这些结果表明抗异常性化合物在20%MeOH洗脱馏分中的存在和富集。提取过程的放大使得20%MeOH馏分的ODS-MPLC分离能够产生7个子馏分，1A-1G。在这七个级分中，只有级分1C(0.15g/kg)显示出抗右旋糖苷活性(图2)。

图1

图2

馏分1E-1G的异常性疼痛评分与赋形剂2组无显著差异(数据未显示)。从级分1C中，通过制备C30高效液相色谱法纯化四种化合物(1–4)。通过光谱分析以及将其质谱和核磁共振数据与已发表文献中的数据进行比较，将这些化合物鉴定为桃叶珊瑚苷(1)、京尼平苷酸(2)、马先蒿内酯(3)和鸢尾内酯(4)(图3)。为了评价这些化合物在体内的抗异常性疼痛活性，按如下方法制备了mg以上的样品。使用市售的化合物1，而使用制备性C30高效液相色谱法纯化化合物2。由于这些化合物在车前子中含量较低，用于动物实验的纯化的化

合物3和4的准备是具有挑战性的。然而，分别含有这些化合物的粗馏分3和4是由ODS-MPLC制备的，并且用于小鼠的活性评价。使用1H-核磁共振，我们确定每个馏分中的主要化合物分别是3或4。定量1H-NMR显示粗馏分3中的化合物3的估计含量为13.4±0.2%，粗馏分4中的化合物4的估计含量为8.4±0.7%。

图3

使用PTX诱导的机械异常性疼痛小鼠模型评价分离的化合物的抗异常性疼痛效果。从PTX注射后的第一天开始，每天口服桃叶珊瑚苷(1，mg/kg)，显著抑制机械性异常性疼痛，从第8天起观察到效果。较低剂量的化合物1(30mg/kg)也保留了类似的抑制作用，在第8天后明

显(图4a)。京尼平苷酸(2，75mg/kg)，如图4b所示，显著与赋形剂2治疗组相比，第7、9和10天异常性疼痛评分降低。然而，这种效应并未持续，并且数值逐渐增加，与对照组相似，这表明化合物2不影响由PTX诱发的机械异常性疼痛。如上所述，马先蒿内酯(3)和鸢尾内酯(4)的活性分别用含有化合物3作为其主要成分的馏分(命名为粗馏分3)和含有化合物4作为其主要成分的馏分(粗馏分4)来评价。从口服粗馏分3(mg/kg)的第6天开始，观察到对机械异常性

疼痛的显著抑制，对于较低剂量的粗馏分3(30mg/kg)也观察到这种效果，尽管在统计学上不显著(图5a)。口服粗馏分4(30和mg/kg)没有表现出抑制作用(图5b)。

图4

结论

本研究有助于阐明GJG的活性成分及其组分车前子具有抗异常性疼痛的活性。因此，在本研究中，进行了活性导向的胞外多糖分离，并鉴定出四种环烯醚萜类化合物(1–4)。除了桃叶珊瑚苷(1)，马先蒿内酯粗品(3)的重复口服给药显示出抗异常性疼痛作用。总的来说，这项研究表明，化合物1和3可以是车前子和GJG的一些活性抗异常性疼痛化合物。桃叶珊瑚苷(1)和马先蒿内酯(3)在CIPN的临床管理中具有治疗应用的潜力。

本文于年6月12日在线发表于杂志：JournalofNaturalMedicines，第一作者是KazufumiToume，ZhiyanHou，HuanhuanYu，YanjingBai，ShihoHanazawa，YueweiGe，KatsukoKomatsu，通讯作者是KazufumiToume和TsugunobuAndoh，通讯单位是日本富山大学天然药物研究所生药学研究室和富山大学医药科学研究生院应用药理学系。

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